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    蛋白质组学详细

    DIA蛋白质组学技术 > DIA蛋白质组学技术

      DIA蛋白质组学技术

      DIA蛋白质组学技术

              DIA(Data independent acquisition)是基于静电场轨道阱Orbitrap带来的一项全新的、全息式数据非依赖性采集定量技术,能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息。相比传统的蛋白质组学采用数据依赖采集(DDA)策略,DIA技术避免了DDA策略对于高丰度肽段采集和碎裂的偏向性,DIA技术对于低丰度肽段的定量具有显著优势。

      DIA技术原理

              DIA技术是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库,之后采用DIA方法进行质谱数据采集,从而实现对样品中蛋白质的定性及定量,不同于传统的DDA技术,DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个可变窗口,根据m/z分布密度计算合理的窗口宽度和数量,高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,该技术无需指定目标肽段,扫描点数均匀,可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息,数据利用度大大提高,缺失值更少(图1)。

      DIA实验流程

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                   图1  DIA技术原理图(来源:LCGC North America.Volume 35, Issue 10, pg 756–759)

      DIA技术优势

      1、高通量与高深度:不受样品个数的限制,可用于大规模样本数量检测,前处理操作过程较少,使样本最接近原始状态,同时不受样品条件限制

      2、特异性好、灵敏度高:全景式扫描,数据无遗漏,定量准确性大大提高

      3、严格的质量控制:鉴定与定量结果的可重复性更高,数据可回溯

      应用领域

                  大规模寻找差异蛋白

                  10个以上样品的定量研究

                  生物标志物筛选

                  血清蛋白组筛选

      案例解析

      DIA与DDA在血清蛋白组分析中的技术对比

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              该文献是一篇标准DIA分析流程的文章。实验流程如图2,建立快速高效的血清蛋白质组学方法,样本制备未进行常规的去高丰度蛋白操作,直接对血清样品进行酶切(图2a)。通过DDA技术在三个技术重复中对未去高丰度蛋白、去高丰度蛋白的样品测定;通过高pH反相分馏将未去高丰度蛋白的样品分为5个馏分,并用DDA分析没个馏分(图)。通过多次DDA鉴定建立血清光谱库,并对DIA数据进行分析。


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                                                                   图2   DIA工作流程和谱库的生成

       

              为了比较DIA方法与传统DDA的特点,通过标准DDA方法对相同的血清样品进行了三次技术重复,并使用相同的50分钟梯度进行分析。

       

      DIA重现性优于DDA

              在三个重复中,DDA共鉴定出202个蛋白质和1495个肽,只有114(56%)个蛋白质和829(55%)个肽在所有重复中均有鉴定。

              而DIA(vDIA-2)鉴定出375种蛋白质和3238个肽,其中325(87%)个蛋白质和2699(83%)个肽被重复鉴定。

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      DIA比DDA定量更准确

              通过MaxQuant分析DDA模式下收集的原始数据,对103个蛋白质进行了定量,其中80个蛋白质的CV<10%,100个蛋白质的CV<20%。

              对于vDIA-2,定量了325种蛋白质,中值CV为7.8%,其中193种蛋白质的CV<10%,256种蛋白质的CV<20%。

      DIA技术对肾细胞癌RCC进行血清蛋白质组学分析

              本研究将DIA工作流程应用于RCC的血清蛋白质组学分析。用DIA方法鉴定了20个样品,包括10例RCC患者和10例健康志愿者。20个样品中共检测到429个蛋白质和3825个肽段。如图5a,其中有273个蛋白质(占总数的63%)在所有样品中被重复鉴定,在80%以上的样品中鉴定出327个蛋白质(占76%)。通过PCR分析(图5b),可以发现RCC患者与健康志愿者两组之间的分离趋势,表明RCC患者与对照组相比存在固有的蛋白质组学变化。


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                                                          图5  RCC血清蛋白组学分析

      小结

              本文通过对比DIA与DDA在鉴定蛋白数目、重复性、定量准确性方面的性能上,体现了DIA技术的优势,并将其应用于RCC血清蛋白质组学分析中,表明DIA在高度复杂的血清样本分析中的可行性,极大提高了定量分析的可信度,有更高的定量准确性和可重复性。

      相关文献

      1、Muntel  J,  et al.  AdvancingUrinary  Protein  Biomarker  Discovery  by Data-independent Acquisition on a Quadrupole-Orbitrap Mass Spectrometer.  J Proteome Res. 2015, 14(11):4752-62.

      2、Miyauchi E, et al. Identification of blood biomarkers in glioblastoma by SWATH mass spectrometry and quantitative targeted absolute proteomics. Plos One, 2018, 13(3):e0193799.

      3、Bruderer R,et al. Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues. Mol Cell Proteomics. 2015 May;14(5):1400-10.

      4、Keam SP, et al. Exploring the oncoproteomic response of human prostate cancer to therapeutic radiation using data-independent acquisition (DIA) mass spectrometry. Prostate. 2018 Jun;78(8):563-575.

       

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